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光绪帝在慈禧太后死前一日逝世，时间过于巧合，外界对其死因历来有诸多揣测。官方文献记载光绪帝为自然病死。但光绪帝系遭杀害的说法也流传甚广，对于主使者又有慈禧太后说、袁世凯说以及李莲英说。
(一)自然病死之说
清代官方文献和宫廷档案记载光绪帝为病死。民国之后，据光绪帝的御医透露，皇帝生前的确身体并不非常健康，主因是不见天日、身体欠运动、心情不佳，导致饮食不正常，却也无病重之迹象。
1980年，整理崇陵光绪帝遗骨时“未发现外伤及中毒迹象”，加上近些年根据对清朝档案的研究，认为光绪帝在生前染病已经相当严重，不但阳痿而且早泄，遗精史长达二十年，光绪三十四年自述：“耳鸣脑响，梦遗滑泄，虚火上冒，下部萎冷”，中年之后已到病入膏肓之步，自然病死一说逐渐成为学术界主流观点。
(二)遇害之说
《崇陵传信录》和《清稗类钞》两书指出：慈禧太后病危期间，曾犹豫对光绪帝要如何处置，遂以自己不久人世的消息透露给光绪帝知道，惟其近侍回报，帝曾微露喜色，故慈禧决意自己病终前，帝须先于自己命终，以免皇帝有再度亲政、否定慈禧生前之布局的可能。
称光绪帝为袁世凯所弑者，以袁负恩反戈，陷帝于万劫不复，帝在瀛台，“日书项城（指袁）名以志其愤”。袁既知帝衔之者深，则不能不惧太后死而帝独生，故加以谋害（见于光绪侄、末帝溥仪所著《我的前半生》及其他）。《瀛台泣血记》以为下手者系李莲英，颇不合李莲英素常“侍上以敬，待下以宽”的行迹。
(三)确证：急性肠胃型****中毒
2003年开始，清西陵文物管理处与央视编导钟里满尝试借由现代法医手法，由光绪所遗留毛发与遗骸中检验出高量砷成份，显示生前有被****毒害的可能性。花了5年时间，反覆验证光绪尸体上的头发、衣物，2008年11月1日，北京市公安局法医检验鉴定中心、中国原子能科学研究院、清西陵文物管理处与****电视台联合召开记者会，发表“清光绪皇帝死因研究报告”，确定光绪是因为****中毒而亡。至于对光绪下毒的凶手，目前仍待进一步调查。
报告指出，专家自2003年起对光绪遗体的头发、遗骨、衣服及墓内外环境样品，进行了反覆的检测、研究和分析。专家发现，光绪的头发截段和衣物上含有剧毒****，沾染在部分衣物和头发上的****总量就已高达约201毫克。正常人口服****60至200毫克就会中毒身亡。
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