1896年澳葡又在大小横琴岛设立军营，公开索要这两个岛屿。两广总督拒绝。1902年，葡萄牙再派员向清政府递交照会，索要对面山和大小横琴岛。清政府外务部拒绝了葡萄牙的索地要求。1908年2月5日，因日本商船二辰丸号偷运*，被中国水师截获。日本与葡萄牙勾结，借口是在葡萄牙管辖的领水内，反要清政府赔礼道歉。这一事件激起中国人民的愤慨，纷纷上书，要求与葡人划定澳门界址。1909年2 月，中葡决定派员勘查界址。香山县各界人士成立“广东勘界谈判维持总会”，担任澳门划界谈判的后盾。在香港进行的谈判，由于葡方坚持索要“澳门属地”，经九次会议，争持不下，陷于僵局，最终划界谈判失败。1910年中葡在北京恢复谈判，因为葡萄牙发生革命，谈判又中断。因此澳门界址终未确定。
中华民国成立后，澳门划界问题再次成为中葡外交交涉的主要问题。1913年葡萄牙公使照会北洋政府，要求划定澳门界址。第二年，葡萄牙公使与北洋政府谈判划界问题，葡方仍坚持在香港谈判的立场，因此没有结果。在划界谈判未果的情况下，葡人采取不断扩充澳门地界的行动。1910年8月葡萄牙人在路环岛大肆烧杀。1911年，葡萄牙人强迫路环九澳地主纳租。1919年，葡萄牙人筑青州堤，试图开辟青州北部地区，经中国政府抗议而作罢。葡萄牙再次要求会同勘界。在陆地界址未果的情况下，葡萄牙又提出澳门水界问题。1928年4月28日
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